Crosley CRSH268MS2 Uživatelský manuál Strana 1

Opzuivering en karakterisatie van antibacteriële componenten tegen Clostridium difficile Marilyn DE GRAEVE Masterproef voor

x SEM Scanning elektronenmicroscopie SLP, SlpA S-laag eiwit SN Supernatans SPE Solid phase extraction chromatografie TEM Transmissie elektronenmi

xi SAMENVATTING Clostridium difficile werd voor het eerst als een potentiële maagzuurbestendige, sporevormende pathogeen herkend in 1978.

xii SUMMARY Clostridium difficile was first recognized as a potential gastric acid resistant, spore producing pathogen in 1978. Now it is regarded

1. Inleiding 1 1. INLEIDING 1.1 CLOSTRIDIUM DIFFICILE: DE KIEM 1.1.1 ALGEMENE KENMERKEN Clostridium difficile is een strikt anaerobe, Gram-pos

1. Inleiding 2 1.1.2 TAXONOMIE De naam Clostridium difficile is afkomstig van het Griekse woord kloster (κλωστήρ) dat staaf betekent en verwijst

1. Inleiding 3 1.2 CLOSTRIDIUM DIFFICILE INFECTIES 1.2.1 DEFINITIE Een C. difficile infectie, of Clostridium difficile geassocieerde ziekte

1. Inleiding 4 darmaandoeningen, het gebruik van protonpompinhibitoren en immunosuppressieve medicatie zoals chemotherapie (Calfee, 2008;

1. Inleiding 5 overgedragen tussen verschillende patiënten. Deze verschillende factoren maakt de sporen erg moeilijk te elimineren uit de omgeving (

1. Inleiding 6 Figuur 1.4 Structuur van TcdA en TcdB. De toxines TcdA en TcdB bestaan uit vier domeinen; een N-terminaal gelegen glycosyltransferase

1. Inleiding 7 difficile isolaten TcdB te produceren en is TcdB ongeveer 1000 maal potenter dan TcdA (Brito et al., 2002; Gerhard et al., 2008; Rieg

ii

1. Inleiding 8 vrijgegeven in het cytosol m.b.v. auto-gekatalyseerde proteolyse. (4) Het glycosyltransferase glycolyseert de Rho GTPase e

1. Inleiding 9 Terwijl het moleculair mechanisme van TcdA en TcdB volledig gekend is, blijven er vragen omtrent de aanleiding naar de infl

1. Inleiding 10 Figuur 1.7 C. difficile kiem en voorspore. TEM van C. difficile wild type (WT) stam JIR8094 na 18 u groei op sporenvormend m

1. Inleiding 11 vivo te hechten aan mucus van het caecum in muizen, het FliD eiwit zou een rol hierin spelen. Zweepharen, en vooral

1. Inleiding 12 In de laatste twee decennia is er een verschuiving opgemerkt in de epidemiologie van CDI’s. CDI’s werden oorspronkelijk gezien a

1. Inleiding 13 CDI BIJ DIEREN EN ZOÖNOTISCH BELANG CDI’s werden als oorzaak voor enteritis in verschillende diersoorten geïdentificeerd. Zo kan C.

1. Inleiding 14 MOLECULAIRE DETECTIE Met behulp van een polymerase kettingreactie (polymerase chain reaction, PCR) of kwantitatieve PCR (q

1. Inleiding 15 Verder kan de transmissie van C. difficile sporen ingeperkt worden door de isolatie van symptomatische patiënten, een p

1. Inleiding 16 Er wordt veel onderzoek gedaan naar alternatieve antibiotica die metronidazol en vancomycine kunnen bijstaan of zelfs verv

1. Inleiding 17 vergelijking met de placebo die enkel het antibiotica bevatte (Lawrence et al., 2005; Pochapin, 2000). Wanneer enkelv

iii DANKWOORD Allereerst wil ik professor Filip Van Immerseel bedanken voor de kans om mijn thesis in een super hechte vakgroep te mogen uitvoeren.

1. Inleiding 18 FECALE BACTERIO-THERAPIE Fecale bacterio-therapie, ofwel het transplanteren van gezonde feces naar een patiënt, is een ee

1. Inleiding 19 na toediening van C. difficile sporen. Muizen met CamSA waren, op een dosis-afhankelijke wijze, beschermd tegen CDI’s. De mu

2. Doelstelling 20 2. DOELSTELLING Verstoring van de darmflora door het gebruik van breedspectrumantibiotica is een belangrijke trigger v

2. Doelstelling 21 Figuur 2.1 Overzicht van de workflow.

3. Resultaten 22 3. RESULTATEN BIJDRAGE VAN DERDEN - Professor Bart Devreese en Isabelle Vandenberghe voor het fractioneren van de AMC SPE fracties

3. Resultaten 23 Figuur 3.2 BA groeicurve en antibacteriële activiteit van B. amyloliquefaciens supernatans. De maximale productie van d

3. Resultaten 24 Figuur 3.3 Invloed van pH op de activiteit van B. amyloliquefaciens supernatans. De pH-stabiliteit werd getest door SN te incube

3. Resultaten 25 Figuur 3.4 Invloed van temperatuur op de activiteit van B. amyloliquefaciens supernatans. De hittestabiliteit van de AMC werd on

3. Resultaten 26 Figuur 3.5 Invloed van proteasen op de activiteit van B. amyloliquefaciens supernatans. De proteolytische resistentie

3. Resultaten 27 3.1.5 EFFECT VAN BA SN OP DARMCELLEN IN VITRO Om na te gaan of BA in vivo kan gebruikt worden, werd de cytotoxiciteit van het super

iv INHOUDSOPGAVE DANKWOORD ...

3. Resultaten 28 3.2 OPZUIVERING AMC VAN B. AMYLOLIQUEFACIENS Doordat de onbekende AMC en Bacillus lipopeptiden vele eigenschappen delen zoals hoge

3. Resultaten 29 3.2.3 HPLC-ESI MASSASPECTROMETRIE SURFACTINE Eerst werd aangekocht surfactine bestudeerd met ESI MS. Surfactine is een

3. Resultaten 30 Vervolgens werd er ingezoomd in het massaspectrogram van het niet-opgezuiverd actief staal bij 1022 Da om de karakteristi

3. Resultaten 31 Figuur 3.11 Massaspectra en chromatogrammen van bacillomycine. A) MS spectrum ingezoomd op 1081 Da. B) Chromatogram van de MS piek

3. Resultaten 32 Figuur 3.12 Massaspectra en chromatogrammen van fengycine. A) MS spectrum ingezoomd op 1463 Da. B) Chromatogram van de MS piek bij

3. Resultaten 33 3.3 SELECTIVITEIT AMC VAN B. AMYLOLIQUEFACIENS Om de selectiviteit van de onbekende AMC in kaart te brengen, werd de a

3. Resultaten 34 24 Staphylococcus intermedius 10052 0 13,2 25 Streptococcus bovis 10091 0 42,9 26 Streptococcus equi subsp. equi 9969 50,0 89,5 27

3. Resultaten 35 Figuur 3.14 Activiteit van BA SN en ZP tegen verschillende genera. De gemiddelde residuele gevoeligheid van verschillende genera aa

3. Resultaten 36 3.4 ANTIBACTERIËLE ACTIVITEIT VAN C. PERFRINGENS 3.4.1 OPTIMALISATIE Om na te gaan in welke omstandigheden het supernatans

3. Resultaten 37 3.4.2 OPZUIVERING AMC VAN CP SN Supernatans van CP38, opgegroeid in CDB2 en opgeconcentreerd m.b.v. een vivaspin, werd gescheiden

v 3.4.1 OPTIMALISATIE ...

3. Resultaten 38 3.5 BEPALING VAN TOXINEGENEN VAN C. DIFFICILE STAMMEN 3.5.1 OPTIMALISATIE VAN PCR Voor de bepaling van de aanwezigheid van t

3. Resultaten 39 Figuur 3.16 Gelelektroforese van multiplex PCR met tcdA, tcdB en tpi primers. Van 26 C. difficile stammen werden de to

3. Resultaten 40 3.5.3 AANWEZIGHEID VAN BINAIRE TOXINEGENEN In de tweede multiplexreactie werd de aanwezigheid van binaire toxinegenen getest d

3. Resultaten 41 Tabel 3.3 Overzicht van C. difficile ribotypes en aanwezige toxinegenen. “Nr.”, nummer; “C. difficile ribotype”, zessentwintig get

4. Discussie 42 4. DISCUSSIE 4.1 KARAKTERISATIE AMC VAN B. AMYLOLIQUEFACIENS 4.1.1 MAXIMALE PRODUCTIE AMC Met behulp van een B. amyloliquefaci

4. Discussie 43 opgeconcentreerd supernatans blijkt geen cytotoxisch effect te hebben op Caco-2 cellen. Opgeconcentreerd supernatans bli

4. Discussie 44 dosis toe te voegen, worden selectief C. difficile cellen vernietigd en blijven andere bacteriën onaangetast. Om het activiteitspe

4. Discussie 45 worden doordat deze effecten werden bestudeerd bij organismen waarvan het genetisch materiaal een hoge GC inhoud bevat ter

5. Materiaal en methoden 46 5. MATERIAAL EN METHODEN 5.1 KARAKTERISATIE AMC VAN B. AMYLOLIQUEFACIENS 5.1.1 MAXIMALE PRODUCTIE AMC Om een verband

5. Materiaal en methoden 47 HBSS- toegevoegd. De stalen werden verzamend na 1 uur en na 24 u incubatie bij 37°C en bewaard bij 4°C. De antibacteriël

vi 7. ADDENDUM ...

5. Materiaal en methoden 48 5.2.2 SOLID PHASE EXTRACTION CHROMATOGRAFIE Met het opgeconcentreerde BA SN werd SPE chromatografie uitgevoerd.

5. Materiaal en methoden 49 Een selectie aerobe en anaerobe isolaten (Tabel 3.1) werd overnacht opgegroeid in BHI of MRS broth. Elke isolaat werd ho

5. Materiaal en methoden 50 werd driemaal geëlueerd met 1 ml 1M NaCl in 10 mM Tris-buffer pH 8,5 (staal 0, staal 1 en staal 2). De fracties van d

5. Materiaal en methoden 51 Er werden telkens vijf DNA stalen geanalyseerd per primerconcentratie met 1,5 µl 10x of 100x verdund DNA, 1

5. Materiaal en methoden 52 condities werden gehanteerd in het PCR programma; denaturatie bij 95°C gedurende 10 min gevolgd door 35 cycli bestaande

6. Referenties 53 6. REFERENTIES Åkerlund, T., Persson, I., Unemo, M., Norén, T., Svenungsson, B., Wullt, M., and Burman, L.G. (2008).

6. Referenties 54 diarrhoea and Clostridium difficile in the community. Aliment. Pharmacol. Ther. 17, 905–912. Beveridge, T.J., Pouwels,

6. Referenties 55 Castagliuolo, I., LaMont, J.T., Qiu, B., Nikulasson, S.T., and Pothoulakis, C. (1996). A receptor decoy inhibits the

6. Referenties 56 Dubberke, E.R., Reske, K.A., Olsen, M.A., McDonald, L.C., and Fraser, V.J. (2008). Short- and long-term attributable costs of

6. Referenties 57 Gaynes, R., Rimland, D., Killum, E., Lowery, H.K., Johnson, T.M., Killgore, G., and Tenover, F.C. (2004). Outbreak

vii LIJST VAN FIGUREN Figuur 1.1 C. difficile bacterie. 1 Figuur 1.2 Darmbiopt van patiënt geïdentificeerd met pseudomembraan colitis. 3 Figuur 1.3

6. Referenties 58 Hue, N., Serani, L., and Laprévote, O. (2001). Structural investigation of cyclic peptidolipids from Bacillus subtilis by

6. Referenties 59 Kelly, C.P., and LaMont, J.T. (2008). Clostridium difficile--more difficult than ever. N. Engl. J. Med. 359, 1932–194

6. Referenties 60 Lyerly, D.M., Saum, K.E., MacDonald, D.K., and Wilkins, T.D. (1985). Effects of Clostridium difficile toxins given intra

6. Referenties 61 a randomized, double-blind study. Clin. Infect. Dis. Off. Publ. Infect. Dis. Soc. Am. 48, e41–46. Muto, C.A., Pokrywka, M., Sh

6. Referenties 62 binary toxin (actin-specific ADP-ribosyltransferase) by Clostridium difficile CD196. Infect. Immun. 65, 1402–1407. Pillai

6. Referenties 63 Sayedy, L., Kothari, D., and Richards, R.J. (2010). Toxic megacolon associated Clostridium difficile colitis. World J.

6. Referenties 64 by strains of Clostridium difficile. FEMS Microbiol. Lett. 186, 307–312. Tamma, P.D., and Sandora, T.J. (2012). Clostridium di

6. Referenties 65 Weese, J. s., Reid-Smith, R. j., Avery, B. p., and Rousseau, J. (2010). Detection and characterization of Clostridium dif

7. Addendum 66 7. ADDENDUM 7.1 BACTERIEËLE MEDIA 7.1.1 VLOEIBARE MEDIA BHI BROTH Het vloeibare medium is aangemaakt met 52 g/l Brain Heart

7. Addendum 67 CDA Van het Clostridium difficile Agar Base (CDA)(Oxoid CM0601) medium werd 49 g/l CDA, 0,1% L-cys-HCl en AD gebruikt. De agar werd

viii LIJST VAN TABELLEN Tabel 3.1 Lijst van bacteriële isolaten en hun gevoeligheid aan B. amyloliquefaciens supernatans. 33 Tabel 3.2 Antibacterië

7. Addendum 68 7.3 RESULTATEN Tabel 7.1 Rauwe data: karakterisatie AMC van B. amyloliquefaciens. MAXIMALE PRODUCTIE AMC Set 1 OD (600 nm) Activitei

7. Addendum 69 38 23 4 13 9 60 14 10-5 10-7 10-7 10-7 10-6 10-6 46 130 66 150 10 35 45 10-6 10-5 10-6 10-6 10-6 10-6 INVLOED VAN PH OP BA SN ACTIVI

7. Addendum 70 0,054 0,669 0,094 0,453 0,698 0,941 0,644 0,819 0,637 0,919 0,551 0,096 0,049 0,599 0,164 0,408 0,726 0,604 0,692 0,692 0,604 0,558 0

7. Addendum 71 A B Figuur 7.1 MS spectra van aangekocht surfactine. A) MS spectrum van surfactine in positieve modus. B) MS spectrum van surfactine

7. Addendum 72 Figuur 7.2 MS spectra van het opgezuiverd actief staal. A) MS spectrum van eerste piekcluster geëlueerd van de HPLC kolom omstreek

7. Addendum 73 Tabel 7.3 Rauwe data: selectiviteit AMC van B. amyloliquefaciens. ”-“, geen groei opgetreden; “ “, niet getest. Nr. Naam BA SN (inhib

7. Addendum 74 Anaerobe stammen 1 Lactobacillus acidophilus 0 0 0 12 12 18 2 Lactobacillus bifermentans - - - - - - 3 Lac

7. Addendum 75 Figuur 7.3 Optimalisatie PCR van toxine A en toxine B. De vijf CD stammen BR001, BR002, BR003, BR012, BR014 werden

7. Addendum 76 Figuur 7.4 Aanwezigheid van toxine A en toxine B genen. Van 26 C. difficile stammen werden de toxinegenen bepaald m.b.v. amplificat

7. Addendum 77 Figuur 7.5 Aanwezigheid van binaire toxinegenen. Van 26 C. difficile stammen werden de toxinegenen bepaald m.b.v. amplificatie met cd

ix LIJST MET AFKORTINGEN 16S rDNA 16S ribosomaal DNA ACN Acetonitril AD Gedestilleerd water ADP Adenosinedifosfaat AFLP Geamplificeerd fragment len

7. Addendum 78 Figuur 7.6 Opstelling NRU assay. De buitenste wells bevatten geen Caco-2 cellen. Tweede kolom, incubatie met caco-2 ce